Interacción entre la hepática Lunularia cruciata y Rhizophagus irregularis: Un estudio de aliviación del estrés inducido por el hidrocarburo aromático policíclico antraceno

Abstract

Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) son contaminantes orgánicos persistentes ampliamente distribuidos en el ambiente que, en la mayoría de los casos, son tóxicos, mutagénicos y cancerígenos para los seres humanos, lo que hace necesario el desarrollo de tecnologías para su remediación ambiental. La fitorremediación consiste en el uso de plantas y microorganismos rizosféricos para eliminar contaminantes ambientales, siendo la inoculación con hongos micorrícicos arbusculares (HMA) uno de los métodos más utilizados para eliminar HAPs del suelo dado que potencian la disipación y la tolerancia de las plantas. Sin embargo, la respuesta de los HMA asociados a plantas no vasculares, como las hepáticas, frente a la contaminación por HAPs, aún se encuentra en desarrollo. En este contexto, la presente tesis tuvo como pregunta central determinar el papel de Rhizophagus irregularis en la hepática Lunularia cruciata frente a la exposición al HAP antraceno, con el fin de generar conocimientos base para el desarrollo de bio-herramientas aplicables en la fitorremediación de estos contaminantes. El objetivo general fue evaluar el rol de R. irregularis en la fitoextracción, la mitigación del estrés oxidativo y la fitotoxicidad en L. cruciata expuesta al antraceno. Para cumplir con este objetivo, se realizaron cultivos de la hepática in vitro, colonizadas o no por el HMA, con diferentes concentraciones de antraceno (0, 100 y 250 μM) bajo condiciones ambientales controladas. Se caracterizó el tipo de colonización en L. cruciata y se evaluó el efecto de las diferentes concentraciones de antraceno sobre la intensidad de colonización fúngica del talo y el desarrollo extramatrical del hongo (Capítulo II). Se encontró que la colonización siguió un patrón morfológico tipo Paris. Además, la intensidad de colonización no se vio afectada por las diferentes concentraciones de antraceno. Sin embargo, a concentraciones de 250 μM se observaron efectos negativos en el desarrollo extramatrical del hongo, disminuyendo la producción de esporas, la formación de estructuras absorbentes ramificadas y la longitud de las hifas, lo que sugiere que altas concentraciones de este contaminante tienen efectos tóxicos sobre el HMA. La capacidad de fitoextracción de antraceno por el sistema hepática-HMA se determinó a partir de la disipación del contaminante del medio de cultivo a diferentes distancias de la planta y su bioacumulación en ambos organismos (Capítulo III). Se encontró que, a concentraciones de 100 μM, la colonización por R. irregularis incrementó significativamente la disipación del antraceno, tanto cerca como lejos de la planta, registrándose la translocación del contaminante desde el hongo hacia la planta, lo que resultó en una mayor bioacumulación. Por otra parte, a 250 μM de antraceno, la inoculación con el HMA causó una mayor disipación en el medio cercano a las plantas, registrándose una menor bioacumulación en el talo, lo que podría deberse a un efecto protector del hongo frente a niveles tóxicos de contaminación. Se analizaron diferentes indicadores de estrés oxidativo en L. cruciata, tales como la actividad de las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y peroxidasa (POD), el contenido de glutatión reducido (GSH), los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el contenido de malondialdehído (MDA) (Capítulo IV). Se encontró que, las plantas colonizadas por R. irregularis expuestas al antraceno presentaron una mayor actividad de las enzimas antioxidantes y un aumento de los niveles de GSH, resultando en una disminución de la acumulación de ROS y menores daños oxidativos en las membranas celulares en comparación con aquellas plantas sin inocular. Por último, se evaluaron indicadores de fitotoxicidad en L. cruciata, tales como el contenido de pigmentos fotosintéticos, el crecimiento, la dependencia micorrícica, la presencia de necrosis, el potencial de reproducción asexual y la tolerancia al antraceno (Capítulo V). Se encontró que las plantas inoculadas con el HMA mantuvieron niveles estables de clorofila y carotenoides bajo la exposición al antraceno, a diferencia de las plantas sin inocular que presentaron una disminución de estos pigmentos. Asimismo, la biomasa aumentó en las plantas asociadas al HMA expuestas al antraceno, lo que se reflejó en un mayor índice de dependencia micorrícica. Además, la colonización por el hongo disminuyó la incidencia de lesiones necróticas en las plantas expuestas al antraceno, junto con un incremento de la reproducción asexual bajo condiciones de contaminación con 250 μM. También se demostró que las plantas colonizadas por el HMA presentaron un mayor índice de tolerancia al antraceno. La presente tesis demuestra que la asociación con el HMA R. irregularis además de cumplir un rol potenciador del carácter fitoextractor del antraceno, tiene un papel importante en la mitigación del estrés oxidativo y la fitotoxicidad inducidos por el antraceno en la hepática L. cruciata en condiciones de cultivo in vitro. Los resultados de este trabajo posicionan al sistema hepática-HMA como una estrategia innovadora y viable para su aplicación en la fitorremediación de suelos contaminados por HAPs, sentando las bases para futuras investigaciones in situ.

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are persistent organic pollutants widely distributed in the environment that, in most cases, are toxic, mutagenic and carcinogenic to humans, making it necessary to develop technologies for their environmental remediation. Phytoremediation consists of the use of plants and rhizospheric microorganisms to eliminate environmental contaminants, with inoculation with arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) being one of the most widely used methods to eliminate PAHs from the soil since they enhance dissipation and plant tolerance. However, the response of AMF associated with non-vascular plants, such as liverwort, to PAH contamination is still under development. In this context, the central question of this thesis was to determine the role of AMF Rhizophagus irregularis in the liverwort Lunularia cruciata when exposed to anthracene, in order to generate basic knowledge for the development of bio-tools applicable to the phytoremediation of these contaminants. The general objective was to evaluate the role of R. irregularis in phytoextraction, mitigation of oxidative stress and phytotoxicity in L. cruciata exposed to anthracene. To meet this objective, in vitro cultures of the liverwort, colonized or not by AMF, were performed with different concentrations of anthracene (0, 100 and 250 μM) under controlled environmental conditions. The type of colonization in L. cruciata was characterized and the effect of different concentrations of anthracene on the intensity of fungal colonization of the thallus and the extramatrical development of the fungus was evaluated (chapter II). It was found that the colonization followed a Paris-type morphological pattern. In addition, the intensity of colonization was not affected by the different concentrations of anthracene. However, at concentrations of 250 μM, negative effects were observed on the extramatrical development of the fungus, decreasing spore production, the formation of branched absorbing structures and the length of hyphae, suggesting that high concentrations of this contaminant have a toxic effect on AMF. The phytoextraction capacity of anthracene by the liverwort-AMF system was determined from the dissipation of the contaminant from the culture medium at different distances from the plant and its bioaccumulation in both organisms (chapter III). It was found that, at concentrations of 100 μM, inoculation with R. irregularis significantly increased the dissipation of anthracene, both near and far from the plant, registering the translocation of the contaminant from the fungus to the plant, which resulted in greater bioaccumulation. On the other hand, at 250 μM of anthracene, inoculation with AMF caused greater dissipation only in the medium close to the plants, registering less bioaccumulation in the thallus, which could be due to a protective effect of the fungus against toxic levels of contamination. Different indicators of oxidative stress in L. cruciata were analyzed, such as the activity of the antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD), the content of reduced glutathione (GSH), the levels of reactive oxygen species (ROS) and the content of malondialdehyde (MDA) (chapter IV). It was found that plants colonized by R. irregularis exposed to anthracene presented a higher activity of antioxidant enzymes and an increase in GSH levels, resulting in a decrease in ROS accumulation and less oxidative damage in cell membranes compared to uninoculated plants. Finally, phytotoxicity indicators in L. cruciata were evaluated, such as photosynthetic pigment content, growth, mycorrhizal dependence, presence of necrosis, asexual reproduction potential, and tolerance to anthracene (chapter V). It was found that plants inoculated with AMF maintained stable levels of chlorophyll and carotenoids under exposure to anthracene, unlike uninoculated plants that showed a decrease in these pigments. Likewise, biomass increased in plants associated with AMF exposed to anthracene, which was reflected in a higher index of mycorrhizal dependence. In addition, colonization by the fungus decreased the incidence of necrotic lesions in plants exposed to anthracene, along with an increase in asexual reproduction under conditions of contamination with 250 μM. It was also shown that plants colonized by AMF showed a higher index of tolerance to anthracene. This thesis demonstrates that the association with the AMF R. irregularis, in addition to playing a role in enhancing the phytoextracting character of anthracene, plays an important role in mitigating oxidative stress and phytotoxicity induced by anthracene in the liverwort L. cruciata under in vitro culture conditions. The results of this work position the liverwort-AMF system as an innovative and viable strategy for its application in the phytoremediation of soils contaminated by PAHs, laying the foundations for future in situ research