Efectos de la interacción entre compuestos tóxicos en Trucha Arcoíris (Oncorhynchus mykiss)

Abstract

En esta tesis se estudiaron los mecanismos de regulación molecular (a través de receptores nucleares) implicados en la biotransformación y excreción del clorpirifos (CLF) e hidrocarburos de petróleo; los efectos de la interacción entre ambos compuestos tóxicos sobre enzimas detoxificantes y la influencia de CLF sobre los transportadores ABCCs en trucha arcoı́ris (Oncorhynchus mykiss). Se ha descripto que algunos hidrocarburos aromáticos policı́clicos (HAP) inducen la expresión de la enzima citocromo P450 mono oxigenasa 1A (CYP1A) a través de la activación del receptor de aril hidrocarburos (AhR). A su vez, la enzima CYP1A cataliza la conversión del pesticida CLF a su derivado más activo, CLF-oxón. De acuerdo a esto, la hipótesis I de esta tesis postula que hidrocarburos aromáticos, presentes en la fracción soluble de petróleo (WAF), activan la vı́a del receptor AhR en el hı́gado de la trucha arcoı́ris, induciendo la expresión y la actividad de la enzima CYP1A con el consiguiente aumento de la toxicidad de CLF. Para ponerla a prueba se expusieron juveniles de O. mykiss en acuarios individuales con y sin WAF in vivo por 48 h (pretratamiento y control) y luego se expusieron finas secciones de hı́gado de individuos de ambos grupos a CLF o control de solvente (acetona, SC). Los peces expuestos a WAF mostraron inducción en la expresión génica de AhR ası́ como de CYP1A. Coherentemente la expresión proteica de CYP1A también se vió inducida, sin embargo no se observó aumento de actividad enzimática de CYP1A (medida como la actividad de 7-etoxi-resorufina-O-desetilasa (EROD)). Por otro lado, la expresión génica del translocador nuclear de AhR (ARNT) fue menor en los peces expuestos a WAF. Además, la exposición a CLF en los hı́gados inhibió las actividades enzimáticas EROD, acetilcolinesterasa (AChE) y carboxilesterasas (CEs) y aumentó la actividad de la enzima detoxificante GST, independientemente del pretratamiento con WAF. El pretratamiento de WAF no afectó las actividades de EROD, AChE y GST. Solo la actividad de CEs se vio afectada por WAF, con un efecto inhibitorio y aditivo al efecto de CLF. En el mismo experimento, se analizó la expresión de genes relacionados con defensa antioxidante y detoxificante, sistema inmune, estrés y de receptores nucleares relacionados con hormonas sexuales y de regulación metabólica, a fin de explorar una posible interacción de la vı́a AhR con otras vı́as regulatorias. En este sentido, la exposición a WAF indujo la expresión génica de los receptores de progesterona, de andrógenos y del receptor X de hı́gado (LXR) pero no afectó a los receptores de estrógenos y mineralocorticoides. Además, la exposición a WAF indujo la expresión de varias interleucinas y afectó la vı́a de las caspasas. Se realizó también un estudio histopatológico del hı́gado el cuál mostró evidencias de esteatosis (acumulación de grasa), que podrı́a asociarse a la inducción de LXR, ya que una de sus funciones es estimular la lipogénesis en hı́gado. La hipótesis II postula que CLF activa la vı́a del receptor de pregnano (PXR) en peces, aumentando la expresión de la baterı́a de genes corriente abajo del elemento regulatorio. Se estudió el efecto de CLF como inductor de PXR y genes que, según la literatura, son activados por la vı́a de este receptor (PXR, CYP3A27, GST, ABCB1/Pgp, UGT ABCC2/MRP2 ) en intestino e hı́gado de juveniles de O.mykiss expuestos in vivo a CLF por 12, 24 y 48 h. En el mismo experimento, se estudió la respuesta de la expresión genica de otras enzimas de Fase I (CYP2M1, CYP2K1 y FMO) y se analizó la expresión de genes de la vı́a AhR a fin de explorar una posible interacción de ambas vı́as regulatorias. El efecto a CLF sobre la vı́a de PXR resultó dependiente del órgano estudiado y del tiempo de exposición. En principio, la expresión de PXR se incrementó solo para el intestino, a las 12 h de exposición, acompañado por una disminución de la expresión de AhR y CYP1A y una inducción del ARNT. En intestino también a las 12 h, se observó disminución de la expresión de AhR y de CYP1A e inducción de ARNT. Por otro lado, en el hı́gado la exposición a CLF, a las 12 h, mostró una disminución en la expresión de los trasportadores ABCB1 y ABCC2 pero no se observó modulada la expresión de ninguno de los receptores (PXR-AhR). Además a las 24 horas de exposición la expresión de ABCC2 continuó disminuida y también disminuyó la expresión de AhR. Mientras que la expresión de UGT (gen regulado por PXR) se observó aumentada, tambień a las 24 horas de exposición. Por último la hipótesis III postula que CLF afecta la función de proteı́nas de transporte responsables de la resistencia a múltiples xenobióticos (MXR), las ABCCs (proteı́nas asociadas a la resistencia multidrogas), produciendo inhibición competitiva, sensibilización o activación del transporte de dichas proteı́nas. Para poner a prueba dicha hipótesis, se realizaron preparaciones ex vivo de intestino y se las expuso a tres concentraciones de CLF. En estas preparaciones se midió la tasa de transporte del sustrato 2,4-dinitrofenil-S-glutatión (DNP-SG, que refleja el de transporte de solutos orgánicos hacia afuera de la célula a través de proteı́nas de membrana de la familia ABCC). Si el CLF fuera sustrato de transporte por ABCC, la tasa de transporte de DNP-SG deberı́a disminuir por competencia. Los resultados de este experimento no muestran inhibición del flujo de DNP-SG, por consiguiente, se considera que las proteı́nas ABCC no participan en el transporte celular de CLF en el intestino de O. mykiss. Por el contrario, se observó estimulación en el transporte de DNP-SG en el corto término y será interesante para trabajos futuros investigar los mecanismos involucrados en dicho efecto. Esta tesis permitió concluı́r que los hidrocarburos presentes en la WAF modulan la vı́a del receptor AhR, activando la expresión de dicho receptor y la de su gen blanco CYP1A en O. mykiss, sin embargo no hay incidencia clara de dicha inducción sobre la actividad de CYP1A ni sobre la toxicidad de CLF. Por otro lado, CLF induce débilmente la vı́a del receptor nuclear PXR y disminuye la expresión de genes de la vı́a de AhR en intestino y en hı́gado. Ademas, la expresión génica de ARNT disminuye cuando se encuentra activada la vı́a de AhR, tanto en hı́gado como en intestino, mostrando una posible forma de regulación de esta vı́a que no ha sido descripta hasta ahora. Por último, se puedo concluı́r que CLF estimula la actividad de proteı́nas transportadoras de la familia ABCC en intestino.

In this thesis, I studied molecular regulation mechanisms (through nuclear receptors), involved in biotransformation and excretion of chlorpyrifos (CLF) and petroleum hydrocarbons; the effects of the interaction between both kinds of compounds over detoxifying enzymes and the influence of CLF on the activity of ABCC (proteins associated with resistance multidrug) transporters in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). It has been described that some polycyclic aromatic hydrocarbons induce the expression of the enzyme cytochrome P450 monooxygenase 1A (CYP1A) through activation of the aryl hydrocarbon receptor (AhR). In turn, CYP1A catalyzes the conversion of the pesticide CLF to its most active derivative, CLF-oxon. According to this, the hypothesis I of this thesis postulates that aromatic hydrocarbons, present in the soluble fraction of petroleum (WAF), induce the AhR pathway leading to increased expression and activity of CYP1A and, to the consequent increase in the toxicity of CLF. In order to test this hypothesis, O. mykiss juveniles were exposed in individual aquariums with and without WAF in vivo for 48 h (pretreatment and control) and then liver thin sections from both groups were exposed to CLF or solvent control (acetone, SC). Fish exposed to WAF showed induction in gene expression of AhR as well as CYP1A. Coherently, CYP1A protein expression was also induced, however no increase was observed in CYP1A activity (measured as 7-ethoxyresorufin O deethylation activity (EROD)). On the other hand, the expression of the AhR nuclear translocator (ARNT) was reduced in fish exposed to WAF. Besides, the exposure to CLF inhibited liver EROD, acetylcholinesterase (AChE) and carboxylesterases (CEs) enzymatic activities and increased the activity of the detoxifying enzyme GST independently of the pretreatment with WAF. The WAF pretreatment did not affect EROD, AChE, or GST activity. Only the CEs activity was affected by WAF, with an inhibitory effect, which was additive to that of CLF. In the same experiment, I studied the expression of genes related to the antioxidant and detoxifying defense, immune system, stress and nuclear receptors related to sex hormones and metabolic regulation, in order to explore a possible interaction of the AhR pathway with other regulatory ways. In this sense, exposure to WAF induced the gene expression of progesterone, androgen receptors and liver X receptor (LXR) but did not affect the estrogen and mineralocorticide receptors. In addition, WAF exposure induced the expression of several interleukins and affected the caspases pathway. A histopathological study of the liver was also carried out showing evidence of steatosis (fat accumulation), which could be associated to the LXR induction, since one of its functions is stimulate lipogenesis in liver. Hypothesis II postulates that CLF activate the pregnane X receptor (PXR) pathway in fish, increases the expression of genes located downstream of the regulatory element. I studied the effect of CLF as a potential inducer of PXR and genes that, according to the literature, are activated by the PXR pathway (PXR, CYP3A27, GST, ABCB1 / Pgp UGT and ABCC2 / MRP2 ) in intestine and liver of O.mykiss exposed in vivo to CLF for 12, 24 and 48 h. In the same experiment, I studied the gene expression of other fase I enzymes (CYP2M1, CYP2K1 and FMO) and genes of the AhR pathway, in order to analyze possible interactions between PXR and AhR pathways. The effect to CLF on the PXR pathway was dependent of the organ studied and the time of exposure. PXR expression was increased only in intestine, at 12 h of exposure, accompanied by a decrease of AhR and CYP1A expression and an induction of ARNT. On the other hand, in the liver, the exposure to CLF at 12 h, caused a decrease in the expression of transporters ABCB1 and ABCC2 but none of the receptors expression was modulated (PXR-AhR). In addition, after 24 h of exposure, the ABCC2 expression remained diminished and also the AhR expression was decreased while the expression of UGT (gene regulated by PXR) was increased. Finally hypothesis III postulates that CLF affects the function of transport proteins responsible for the resistance to multiple xenobiotics (MXR), the ABCCs, producing competitive inhibition, sensitization or activation of the transport of these proteins. In order to test this hypothesis, ex vivo preparations at three concentrations of CLF was performed, messuring the substrate transport rate of 2,4-dinitrophenyl-S-glutathione (DNP-SG, which reflects the transport out of the cell through the basolateral and apical membranes mediated by multidrug resistance-associated proteins (MRPs/ABCCs) proteins). I expected that if CLF was exported by ABCC, the DNP-SG transport rate would be competitively inhibited. CLF did not inhibit DNP-SG transport and, therefore, it would not be excreted by these proteins. On the contrary, DNP-SG transport was stimulated, which deserves further attention in future studies. This thesis concluded that hydrocarbons present in the WAF modulate the route of the AhR receptor, activating its expression and that of its target gene CYP1A in Oncorhynchus mykiss, however there is no clear incidence of this induction on CYP1A activity and CLF toxicity. On the other hand, CLF weakly induces the pathway of the nuclear receptor PXR and decreases the gene expression of the AhR pathway in intestine and liver. Besides, the gene expression of ARNT decreases when the AhR pathway is activated, both in the liver and in the intestine, showing a possible regulation which was not reported beforehand. Finally, it can be conclusion