Modulación de la transcripción de esterasas en la placenta y el trofoblasto inducida por la exposición a plaguicidas

Abstract

La exposición prenatal a plaguicidas es una problemática de gran relevancia a nivel mundial. En el Alto Valle de Río Negro y Neuquén históricamente se han utilizado diversas familias de plaguicidas, destacándose los plaguicidas organoclorados (POCs), actualmente prohibidos, y los plaguicidas organofosforados (OFs), de los cuales el insecticida clorpirifos (CP) fue el más utilizado hasta el año 2023. Una vez que la persona embarazada se expone a los plaguicidas, estos alcanzan la placenta pudiendo afectar tanto la salud materna como la del feto. En este estudio se analizó la presencia de plaguicidas en placentas de residentes del Alto Valle de Río Negro y Neuquén y se evaluó su impacto en la expresión y actividad de las enzimas esterasas, particularmente las carboxilesterasas (CES) y paraoxonasas (PON). Para esto, entre los años 2018 y 2021 se recolectaron 90 placentas de personas sanas, residentes en zonas rurales del Alto Valle (n=50) y en la ciudad de Neuquén (n=40). Se registraron los parámetros morfométricos de los neonatos y las placentas y se analizaron las concentraciones de plaguicidas prohibidos y de uso actual mediante cromatografía gaseosa con detector de captura de electrones y cromatografía gaseosa acoplada a espectrómetro de masas. Además, se analizaron muestras de frutas, de aire y agua de consumo de red y de pozo. Complementariamente, se realizó la exposición in vitro a CP (0,01-100 μM), utilizando la línea celular de trofoblasto HTR-8/SVneo. La actividad de CES se evaluó en ambos modelos utilizando los sustratos α-naftil acetato (α-NA) y acetato de 4-metilumbeliferilo (4-MUBA). También, en placenta se realizó la caracterización de las isoformas de CES mediante la electroforesis en geles no desnaturalizantes de poliacrilamida. La actividad arilesterasa y lactonasa de las PON, se determinó tanto en placentas como en la línea celular y se determinaron los niveles de expresión de los genes CES1, CES2, CES3, PON1, PON2 y PON3 mediante qPCR. En muestras de placenta, se determinó la expresión proteica de CES y PON mediante el ensayo de Western Blot, se analizaron las asociaciones entre las variables estudiadas y se realizó un Análisis Factorial Múltiple (AFM) para caracterizar la relación entre las variables cuantitativas y categóricas. La concentración media de plaguicidas totales en placentas fue de 534,77 ± 1.007,14 ng/g lípidos (n=85), de la cual el 93% correspondió a ΣDDTs, CP y Σendosulfanes. Aunque no se observaron diferencias significativas en las características sociodemográficas ni en los parámetros de los neonatos y las placentas, entre los grupos, los niveles de plaguicidas totales del grupo rural fueron 285 % más altos que los del grupo urbano (p=0,0003 Mann Whitney). También los niveles de CP en las muestras rurales fueron 121,56 % más altos respecto a las urbanas (p=0,032 M.W.). Las muestras rurales tuvieron un mayor porcentaje de detección en comparación con las urbanas (p=0,026 prueba de Fisher), siendo los plaguicidas más frecuentemente detectados el clorpirifos, el heptacloro y el DDT. Tanto en las muestras de fruta como de aire, no se registró ninguno de los plaguicidas analizados, mientras que en las muestras de agua de red (n=2) y agua de pozo (n=2) solo se detectó CP en concentraciones inferiores a los valores de referencia. A nivel enzimático, la actividad CES determinada con el sustrato α-NA, fue un 18 % menor en las placentas rurales (p=0,0009 Mann Whitney), mientras que no se observaron diferencias significativas utilizando el sustrato 4-MUBA (p=0,914 M.W.). En cuanto a la actividad de las PON, se observó un aumento del 50 % en la actividad arilesterasa y 38 % de la actividad lactonasa en el grupo rural (p=0,048 y p=0,030 M. W.respectivamente). En las placentas analizadas se observó la expresión de transcriptos de CES1, CES2, PON2 y PON3, aunque esta última no pudo ser cuantificada debido a su baja expresión. La expresión de los transcriptos de CES1, CES2 y PON2 fue 5, 6 y 3 veces mayor en las muestras rurales, respectivamente (p=0,0303; p=0,0045 y p=0,0077 M.W. respectivamente). De igual manera, la expresión proteica de CES 1, fue un 72 % mayor (p=0,343 M.W.) y la de PON2 un 75 % mayor (p=0,030 prueba t) en las muestras rurales respecto a las urbanas. Por su parte, los ensayos in vitro en células de trofoblasto HTR-8/SVneo, mostraron una disminución de la actividad CES, determinada con α-NA, del 26 % y 41 % a la mayor concentración en la exposición a 24 y 48 h, respectivamente (p≤0,05 prueba de Dunnett), mientras que no se observaron cambios en la actividad CES determinada con el sustrato 4-MUBA. La actividad arilesterasa de las PON, se vio aumentada en un 29 % y 42 % (p≤0,05 prueba de Dunnett), en las células expuestas a 100 μM de CP durante 24 y 48 h respectivamente, mientras que la actividad lactonasa de las PON no pudo ser determinada. En la línea celular no se encontraron diferencias significativas en la expresión de los transcriptos de CES2 y PON2 por qPCR, a ninguna de las concentraciones, tanto a 24 como 48 h de exposición. Este estudio confirma la presencia de plaguicidas en la placenta de mujeres del Alto Valle de Río Negro y Neuquén. Si bien se determinaron mayores concentraciones en las muestras de residentes rurales, la presencia de plaguicidas en las muestras urbanas evidencia la existencia de múltiples vías de exposición. Dicha exposición produjo alteraciones en la actividad y expresión de las esterasas CES y PON en las placentas, de manera similar a lo observado en el estudio in vitro. Estos hallazgos resaltan la importancia del monitoreo ambiental y de la implementación de estrategias de prevención para reducir la exposición a plaguicidas durante el embarazo, con el objetivo de minimizar los riesgos asociados para la madre y el feto.

Prenatal exposure to pesticides is a globally significant issue. In the Alto Valle region of Río Negro and Neuquén, various pesticide families have historically been used, notably organochlorine pesticides (OCPs), which are currently banned, and organophosphorus pesticides (OPs), among which the insecticide chlorpyrifos (CP) was the most widely used until 2023. Once a pregnant individual is exposed to these pesticides, they reach the placenta, potentially affecting both maternal and fetal health. In this study, we analyzed the presence of pesticides in placentas from residents of the Alto Valle region of Río Negro and Neuquén and evaluated their impact on the expression and activity of esterase enzymes, particularly carboxylesterases (CES) and paraoxonases (PON). Between 2018 and 2021, 90 placentas were collected from healthy individuals, residents in rural areas of the Alto Valle (n=50) and in the city of Neuquén (n=40). Neonatal and placental morphometric parameters were recorded, and concentrations of banned and currently used pesticides were determined using gas chromatography with an electron capture detector and gas chromatography coupled to a mass spectrometer. Additionally, fruit, air, and tap and well water samples were analyzed. Complementarily, in vitro exposures to CP (0.01–100 μM) were performed using the HTR-8/SVneo trophoblast cell line. CES activity was assessed in both models using the substrates α-naphthyl acetate (α-NA) and 4-methylumbelliferyl acetate (4-MUBA). In placental samples, CES isoforms were characterized by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. The arylesterase and lactonase activities of PON were determined in both placentas and the cell line, and the expression levels of the genes CES1, CES2, CES3, PON1, PON2, and PON3 were measured by qPCR. In placental samples, CES and PON protein expression was evaluated via Western Blot, associations among the studied variables were analyzed, and a Multiple Factor Analysis (MFA) was performed to characterize the relationships between quantitative and categorical variables. The mean total pesticide concentration in placentas was 534.77 ± 1,007.14 ng/g lipids (n = 85), of which 93% corresponding to ΣDDTs, CP, and Σendosulfanes. Although no significant differences in sociodemographic characteristics or neonatal and placental parameters were observed between groups, the total pesticide levels in the rural group were 285 % higher than those in the urban group (p=0.0003 Mann–Whitney). CP levels in rural samples were 121.56 % higher than in urban samples (p = 0.032 M.W.). Rural samples also exhibited a higher detection rate (p = 0.026 Fisher’s test), with CP, heptachlor, and DDT being the most frequently detected pesticides. None of the analyzed pesticides were detected in fruit or air samples, while in tap (n=2) and well water (n=2) samples, only CP was detected at concentrations below the reference values. At the enzymatic level, CES activity determined with α-NA was 18% lower in rural placentas (p=0.0009 M.W.), whereas no significant differences were observed with 4-MUBA (p=0.914 M.W.). Regarding PON activity, arylesterase and lactonase activities increased by 50% and 38%, respectively, in the rural group (p=0.048 and p=0.030, M.W.). In the analyzed placentas, transcripts for CES1, CES2, PON2, and PON3 were detected, although the latter could not be quantified due to its low expression. Transcript levels of CES1, CES2, and PON2 were 5-, 6-, and 3-fold higher, respectively, in rural samples (p=0.0303, p=0.0045, and p=0.0077 M.W.). Similarly, CES1 protein expression was 72% higher (p=0.343 M.W.) and PON2 protein expression was 75% higher (p=0.030 t-test) in rural samples compared to urban ones. In vitro assays using HTR-8/SVneo trophoblast cells revealed a 26% and 41% decrease in CES activity (with α-NA) at the highest CP concentration after 24 and 48 hours of exposure, respectively (p≤0.05 Dunnett’s test), with no changes observed using 4-MUBA. Additionally, PON arylesterase activity increased by 29% and 42% (p≤0.05 Dunnett’s test) in cells exposed to 100 μM of CP for 24 and 48 hours, respectively, while PON lactonase activity could not be determined. In the cell line, no significant differences in the expression of CES2 and PON2 transcripts by qPCR were observed in the cell line at any concentration or time point. This study confirms the presence of pesticides in the placentas of women from the Alto Valle region. Although higher concentrations were found in samples from rural residents, the presence of pesticides in urban samples indicates multiple exposure routes. This exposure led to alterations in the activity and expression of CES and PON esterases in placentas, similarly to what was observed in the in vitro study. These results underscore the importance of environmental monitoring and the implementation of preventive strategies to reduce pesticide exposure during pregnancy, aiming to minimize the associated risks to both the mother and fetus.